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技术文章
层析实验冷柜厂家浅谈层析的四种方法
点击次数:1168 发布时间:2015-09-02 打印本页面 返回

一、凝胶过滤层析

    凝胶过滤分子筛层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相,对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。具有分子筛作用的物质很多,如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。

    凝胶过滤层析的应用

1、可分离相对分子量从几百到几十万的物质具有3000个理论塔板的凝胶过滤可将分子量相差2倍的蛋白质完全分开,6000个理论塔板的可将分子量相差1.5倍的蛋白质完全分开;建议柱高在80-120cm,直径=H/30

2.脱盐

   凝胶过滤层析的特点:

1、层析柱规模很大,实验室1.0-2.5×30-100cm,工艺10-20×200cm,从而设备成本很高;

2、上样体积少,必须少于柱床体积的3%才能达到较好的分离效果,如果大体积样品必须浓缩,从而造成样品的损失和增大工艺的复杂性;

3、工艺时间(生产周期)长,甚至24小时或以上;

4、分辨率低;

5、不需摸索纯化条件,按照分子量区带分离。因此,往往用分子筛分离时只适用于纯化的后一步,或离子交换上样前的脱盐。

二、离子交换层析

    离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相,利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。

1、缓冲液与pH:选择适当的缓冲体系,起始浓度要尽可能低些(0.01-0.05M)缓冲液PH值:阳离子低于pI一个pH单位以上阴离子通常高于pI一个pH单位以上。蛋白质在不同pH下保留行为差别较大,所以许对缓冲体系和操作pH进行摸索,以得到佳层析条件。

2、离子强度;洗脱时多采用离子浓度梯度,常加NaCl,KCl,LiCl等.在不同盐浓度(离子强度)及其不同变化率(梯度)条件下保留行为不同,需对该条件进行摸索。一般的,随离子强度增加,蛋白质保留值减小。

三、疏水层析

原理:基于生物分子表面疏水性不同而达到分离的技术。疏水作用来自于分子的水化结构,高浓度盐溶液破坏生物分子的水化结构,使蛋白质内部的疏水基团暴露于分子外表面,从而可与疏水介质结合。不同离子的疏水性–Anions:SO42->Cl->Br->NO3->ClO4->I->SCN–Cations:Mg2+>Li+>Na+>K+>NH4+。

    蛋白质以高浓度盐溶液结合与疏水层析柱上,以低浓度盐溶液洗脱。生物分子表面大都有或强或弱的疏水区域,在不同环境下,与各种疏水介质产生不同强弱的结合。高离子强度可加强疏水性。跟离子交换相反,高盐吸附,低盐洗脱;洗脱样品又可直接或稍加稀释后加上其他层析柱,作为连接层析步骤的桥梁,取代盐析沉淀技术。配体种类繁多,很难预测哪一种、哪一个条件适合,可用疏水层析试盒选择介质

四、亲和层析

    亲和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力,从而达到分离目的的一类特殊层析技术。亲和层析纯化过程简单、迅速,且分离效率高。

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